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  • ISSN 1000-0240 
  • 创刊于1979年
  • 主管单位:中国科学院
  • 主办单位:中国科学院寒区旱区
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冰川冻土, 2020, 42(4): 1308-1320 doi: 10.7522/j.issn.1000-0240.2020.0104

冰冻圈生态学

天山乌鲁木齐河源1号冰川浅冰芯中红酵母菌多样性及种系的产酶特性分析

薛梅,1, 张瑞蕊2, 张艳1, 关波1, 靳亚梅1, 倪永清,1

1.石河子大学 食品学院,新疆 石河子 832000

2.石河子大学 生命科学学院,新疆 石河子 832000

Diversity and extracellular enzyme activities of Rhodotorula strains isolated from surface ice core of the Glacier No.1 at headwaters of Urumqi River, Tianshan Mountains

XUE Mei,1, ZHANG Ruirui2, ZHANG Yan1, GUAN Bo1, JIN Yamei1, NI Yongqing,1

1.School of Food Sciences,Shihezi University,Shihezi 832000,Xinjiang,China

2.School of Life Sciences,Shihezi University,Shihezi 832000,Xinjiang,China

通讯作者: 倪永清, 教授, 从事冰川微生物生态及低温微生物生物技术研究. E-mail: niyqlzu@sina.com.

编委: 周成林

收稿日期: 2018-12-28   修回日期: 2020-05-25  

基金资助: 国家自然科学基金项目.  41971070.  41271268

Received: 2018-12-28   Revised: 2020-05-25  

作者简介 About authors

薛梅(1995-),女,山东日照人,2017年在泰山学院获学士学位,现为石河子大学在读硕士研究生,从事低温微生物研究.E-mail:1259402720@qq.com , E-mail:1259402720@qq.com

摘要

采用4种分离培养基分离可培养酵母菌, 通过分析ITS区序列确定菌株的分类地位。利用多点接触法筛选产酶菌株, 并对菌株的生理生化特征进行比较分析。结果显示: 从乌鲁木齐河源1号冰川(简称乌源1号冰川)浅冰芯中一共分离得到317株酵母菌, 通过ITS rRNA基因序列的NCBI比对和MSP-PCR指纹分型分析发现其中45株为原红酵母菌(Rhodotorula), 分为5个种R.glutinisR.araucariaeR.mucilaginosaR.kratochvilovaeR.diobovata。通过方差分析和聚类分析对45株红酵母进行产酶差异分析, 揭示红酵母菌的各个种群与胞外酶活性的关系。所有菌株至少产两种胞外酶, 其中产纤维素酶菌株占98%, 产果胶酶菌株占100%, 产淀粉酶和脲酶的菌株各47%, 产蛋白酶和脂肪酶的菌株分别占20%和9%, 而菌株YHB-9、 YHB-15、 YHB-39和YHB-45可以产5种酶, 所有菌株都不产几丁质酶。19株菌的最适生长温度在21 ℃左右, 26株菌的最适生长温度在24 ℃左右, 属于耐冷酵母菌。此外, 乌源1号冰川浅冰芯中分离出的红酵母的产酶性状没有表现出物种特异性, 即种间差异不显著, 但产低温酶性能良好, 在生物技术应用方面具有良好的开发潜力。

关键词: 乌源1号冰川 ; 浅冰芯 ; 红酵母菌 ; 低温酶

Abstract

Culturable yeast was recovered by using RDBC, DG, MYP and MYP5 media, and the taxonomic position of the strains was determined by Internal Transcribed Spacer (ITS) sequence analysis. Enzyme producing strains were screened by a multi-point contact method, and the physiological and biochemical characteristics of the strains were comparatively analyzed. A total of 317 culturable yeasts were isolated from the surface ice core of Urumqi Glacier No.1. The results of NCBI blast of ITS rRNA gene sequence and MSP-PCR fingerprinting showed that 45 Rhodotorula strains isolated phylogenetically belonged to five recognized species: R.glutinisR.araucariaeR.mucilaginosaR.kratochvilovae and R.diobovata. The relationship between Rhodotorula species and their extracellular enzyme activity was revealed by ANOVA and cluster analysis. All strains produced at least two extracellular enzymes. Particularly, strains YHB-9, YHB-15, YHB-39, and YHB-45 can produce 5 kinds of enzymes. Among all 45 Rhodotorula strains, 100%, 98%, 47%, 20% and 9% strains produced pectinase, cellulase, amylase and urease, protease and lipase, respectively. By contrast, no strains produced chitinase. Physiological assay showed that the optimum growth temperature of 19 strains of yeast strains was around 21 ℃, whereas that of the other 26 strains was 24 ℃, indicating they belonged to psychrotolerant yeasts. Also, Rhodotorula yeast of the supraglacial habitats of the Glacier No.1 at headwater of Urumqi river in the Tianshan Mountains did not exhibit species-specificity of enzyme-producing properties (no significantly differences between species). However, the enzyme-producing flexibility of Rhodotorula species indicates that strains of part cryotolerant yeast has a great potential in biotechnology applications.

Keywords: Urumqi Glacier No.1 ; surfaceice core ; Rhodotorula ; cold-adapted enzyme

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本文引用格式

薛梅, 张瑞蕊, 张艳, 关波, 靳亚梅, 倪永清. 天山乌鲁木齐河源1号冰川浅冰芯中红酵母菌多样性及种系的产酶特性分析[J]. 冰川冻土, 2020, 42(4): 1308-1320 doi:10.7522/j.issn.1000-0240.2020.0104

XUE Mei, ZHANG Ruirui, ZHANG Yan, GUAN Bo, JIN Yamei, NI Yongqing. Diversity and extracellular enzyme activities of Rhodotorula strains isolated from surface ice core of the Glacier No.1 at headwaters of Urumqi River, Tianshan Mountains[J]. Journal of Glaciology and Geocryology, 2020, 42(4): 1308-1320 doi:10.7522/j.issn.1000-0240.2020.0104

0 引言

冰川占地球陆地面积的10%~11%, 对维持地球生态系统的平衡、 全球气候的稳定发挥着极其重要的作用1-2。近几十年来的研究发现, 冰川表面的冰尘、 积雪、 冰芯及冰川底部生境同常温生态系统类似, 也是由细菌、 真菌、 微藻、 原生动物等各种生物介导和促进的生物地球化学过程, 低温环境中的微生物对维持冰川的生态平衡、 碳氮等元素的循环有重要作用3。随着全球气候变暖趋势的加剧, 地球上绝大多数冰原及冰川处于持续退缩中, 预计到2050年冰川面积将会比1980年减少一半(54%)4。全球气候变暖在加剧由微生物介导的生物地球化学过程的同时, 也显著影响了冰川的退缩及其前沿生境、 下游融水流域体系的生态学过程, 进而影响到局域的气候变化和生态系统生物多样性5。而冰川微生物在基因资源的挖掘利用、 低温酶的开发以及生物修复等方面的应用潜力巨大6。因此, 保护冰川环境中的生物资源刻不容缓。

酵母菌是发酵工业和生物技术方面与人类关系最为密切的一类真核微生物。目前发现冰川生境中也广泛分布酵母菌7。研究显示, 冰川来源的酵母菌能够产各种低温酶, 最常见酶包括淀粉酶、 纤维素酶、 果胶酶、 几丁质酶、 蛋白酶和脂肪酶等。这些酶在食品、 生物燃料以及洗涤剂行业中有很大的应用价值, 譬如低温蛋白酶在食品工业中, 可用于加速奶酪成熟、 保持冷藏肉制品的鲜嫩、 防止葡萄酒酿造中由蛋白质产生的浑浊8。在纺织工业中, 蛋白酶可用于“冷洗”工艺和常温洗涤纺织品的污垢去除。耐低温果胶酶可应用在果汁澄清, 低温条件下防止食品的微生物污染和保护热敏性物质9。此外, 有研究表明, 部分低温酵母菌可以生产在商业中有重要价值的类胡萝卜素, 如β-胡萝卜素、 圆酵母素(torulene)、 红酵母红素(torularhodin)和虾青素10, 这些类胡萝卜素可以作为维生素A的前体物质被添加到食品和饲料中。

前期研究资料显示, 在冰川中分布最广泛、 抗逆性极强、 产类胡萝卜素一类担子菌酵母是红酵母属(Rhodotorula)。这些酵母菌在南极、 北极、 高山冰川以及海冰等低温环境被频繁分离11。传统的Rhodotorula酵母是一个多系起源的分类单元(polyphyletic taxa), 隶属于其中的成员生理生化特性多样复杂, 系统发育甚至横跨了不同的纲(Class)12。根据最新的基于分子系统学方法的酵母菌分类系统, 原Rhodotorula属的分类进行了修订, 只有一些种被保留, 其他成员被划分到不同的属, 包括SymmetrosporaBuckleyzymaMicrosporomyces、 Sakaguchia、 Cystobasidium、 Colacogloea、 Pseudohyphozyma、 PhenoliferiaRhodosporidiobolus13

乌鲁木齐河源1号冰川(简称乌源1号冰川)位于天山中段天格尔峰北坡, 属于大陆型冰川, 是我国监测时间最长、 研究最为系统的冰川, 也是世界冰川监测服务处(WGMS)设立的全球10个重点观测的参照冰川之一14。作者团队前期对乌源1号冰川表面积雪、 表面冰尘和底部沉积层等生境中的真菌和酵母菌多样性分别做了报道15-16, 同时对乌源1号冰川细菌产酶特征进行了研究。考虑到目前为止低温酶生物技术并不成熟, 尤其对我国冰川酵母菌资源和低温酶的研究报道很少, 需要相关研究填补空白。本文从乌源1号冰川浅冰芯中分离到产色素的菌株45株, 隶属于新修订后的红酵母属(Rhodotorula), 重点比较了菌株胞外酶谱的种间和种内差异, 以及生长温度的种属差异性, 以期为高效产低温酶和色素菌株的开发与应用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂和仪器

DNA分子量marker及其他PCR扩增所需试剂均购自天根生化科技(北京)有限公司; 其余试剂均为进口或国产分析纯; PCR引物购自上海捷瑞生物工程有限公司; 光学显微镜, 德国生产Leica DM3000; MiniBeadbeater-16珠磨式组织研磨器, 美国Biospec公司; PCR仪, 德国Biometra公司Tprofessional; 凝胶成像系统, 法国Vilber多功能成像系统; 水平电泳仪, 美国BioRad公司PowerPac Universal; 电泳槽SUBCEILGT(20 cm×25 cm)。

1.1.2 样品采集

于2017年7月在乌源1号冰川(43°06′ N, 86°49′ E)表面共设置3个取样点, 取样点间隔5 m, 每个取样点设置2个平行样点, 用酒精灼烧灭菌的冰镐剔除表层冰样, 采用取样器钻取表层15~40 cm的冰层, 样品采集后迅速装入已灭菌的保温桶中, 置于车载冰箱中当天运回实验室。部分样品保存在-80 ℃超低温冰箱, 用于菌株分离的样品暂置于-20 ℃冰箱中保存。

1.2 酵母菌的分离纯化

将用于菌种分离的样品在室温下融化, 用孔径0.45 μm、 直径47 mm的无菌硝化纤维膜过滤冰芯融水17。将过滤后的膜分别置于四种培养基表面, RDBC培养基、 DG培养基、 MYP培养基、 MYP5培养基18。培养皿分别置于4 ℃和16 ℃下培养14 d后挑取酵母菌单菌落。挑取的单菌落经划线分离纯化后分别用于菌种保藏和提取DNA。

1.2.1 分离培养基

RDBC培养基: 蛋白胨10 g·L-1, 葡萄糖20 g·L-1, KH2PO4 1 g·L-1, MgSO47H2O 0.5 g·L-1, 琼脂粉16 g·L-1, Rose Bengal 0.03 g·L-1, 氯硝胺0.002 g·L-1, pH 6.5; DG培养基: 甘油18 g·L-1, 蛋白胨5 g·L-1, 葡萄糖10 g·L-1, KH2PO4 1 g·L-1, MgSO4·7 H2O 0.5 g·L-1, 琼脂 16 g·L-1, 氯硝胺0.002 g·L-1, pH 5.6; MYP培养基: 麦芽浸粉7 g·L-1, 酵母浸粉0.5 g·L-1, 大豆蛋白胨2.5 g·L-1, 琼脂15 g·L-1; MYP5培养基: 麦芽浸粉7 g·L-1, 葡萄糖1 g·L-1, 酵母浸粉5 g·L-1, 大豆蛋白胨2.5 g·L-1, 氯化钠50 g·L-1, 琼脂15 g·L-1

1.2.2 富集培养基

YM培养基: 麦芽浸粉2.5 g·L-1, 葡萄糖1 g·L-1, 酵母浸粉2.5 g·L-1, 大豆蛋白胨5 g·L-1

1.3 菌株DNA的提取

DNA提取参考Almeida等19的方法, 略有改动。在1.5 mL无菌保藏管中加入500 μL 1×TE缓冲液, 于超净工作台中将在培养皿中已划线纯化的单菌落用无菌接种环挑入无菌保藏管中, 并加入200 μL 424~600 μm的玻璃珠。将无菌保藏管置于MiniBeadbeater-16珠磨式组织研磨器上剧烈震荡2 min, 4 ℃下10 000 r·min-1离心10 min。吸取上层含有DNA的上清液转移到1.5 mL的无菌离心管中并保藏于-20 ℃冰箱中。

1.4 基于MSP-PCR对酵母菌株的指纹分型

以M13(5’-GAGGGTGGCGGTTCT-3’)为单引物对纯培养物通过MSP-PCR进行基因分型, 所有PCR反应均在25 μL反应体系(预混液: 12.5 μL; ddH2O: 9.5 μL; DNA模板: 2 μL; 引物: 1 μL)中进行。反应程序: 95 ℃预变性5 min, 95 ℃变性40 s, 55 ℃退火1 min, 72 ℃延伸1 min, 40 cycles, 72 ℃延伸5 min。扩增产物在2%的琼脂糖凝胶电泳中检测。具有相同DNA带型的菌株被认为是同一物种。

1.5 ITS基因间隔序列的扩增及菌株系统发育分析

将扩增后MSP-PCR条带对比去重后, 挑取同一基因型中的代表菌株以ITS1f(5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’)和ITS4(5’-TCCT-CCGCTTATTGATATGC-3’)为引物进行PCR扩增rRNA基因的ITS序列。PCR反应在25 μL的反应体系(预混液: 12.5 μL; ddH2O: 9.5 μL; DNA模板: 2 μL; 引物: 各0.5 μL)中进行。反应程序: 94 ℃预变性3 min; 95 ℃变性30 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s; 40 cycles, 72 ℃延伸6 min。PCR产物由上海生工生物科技限公司测序。

将获得的序列在NCBI(National Center of Biotechnology Information)-GenBank(http://www.ncbi.nml.nih.gov)的BLASTN搜索获得的其他酵母序列进行比较。在CLUSTALX1.8程序比对序列。使用neighbor-joining method计算进化距离, 在MEGA6.0软件中用p-distances和Kimura-2parameter双参数法构建系统发育树, 并用bootstrap检验进化树分支聚类的置信度, 重复1 000次20

1.6 酵母菌最适生长温度与耐盐度测定

菌株最适生长温度的测定: 将产酶菌株的液体培养液按2%的接种量接入装有5 mL YM液体富集培养基的试管中, 分别置于4、 10、 15、 18、 21、 24、 30、 37 ℃八个温度梯度下培养, 培养96 h后420 nm测OD值。

菌株的耐盐性测定: 在YM液体培养基中分别加入2%、 4%、 6%、 8%浓度的氯化钠溶液, 按2%的接种量接入产酶菌株, 15 ℃下培养96 h后, 420 nm测OD值。

1.7 菌株的产酶特性检测
1.7.1 淀粉酶活性

在补充有2%可溶性淀粉、 pH 6.0的YM培养基上筛选产淀粉酶菌株17。阳性结果表现为当平板上充满1 mL碘液时, 在紫色背景下菌落周围显现透明水解圈。

1.7.2 脂肪酶活性

在含有蛋白胨10 g·L-1、 氯化钠5 g·L-1、 CaCl2·2H2O 0.1 g·L-1、 吐温80 10 g·L-1、 琼脂20 g·L-1、 pH 6.8的培养基上筛选脂肪酶活性菌株21。菌落周围有清晰地水解圈代表产脂肪酶。

1.7.3 纤维素酶活性

YNB 6.7 g·L-1、 葡萄糖1 g·L-1、 纤维素5 g·L-1、 琼脂20 g·L-1。用1 mg·mL-1的刚果红溶液淹没平板, 15 min后倒出。然后将板用1 mol·L-1 NaCl浸没15 min。阳性纤维素酶活性定义为红色背景上菌落周围的清晰水解圈22

1.7.4 蛋白酶活性

在补充有2%酪蛋白和1.5%琼脂的培养基(pH 6.6)中筛选产蛋白酶的菌株。在菌落周围有透明圈的为阳性20

1.7.5 果胶酶活性

在以果胶为底物的培养基上筛选有果胶酶活性的菌株(果胶10 g·L-1; YNB 6.7 g·L-1; 琼脂20 g·-1L; pH 7.0)。平板上充满1%十六烷基三甲基溴化铵, 菌落周围产生的清晰地透明圈为阳性结果23

1.7.6 几丁质酶活性

酵母提取物0.2 g·L-1、 (NH42SO4 2 g·L-1、 KH2PO4 4 g·L-1、 Na2HPO4 6 g·L-1、 FeSO4·7H2O 0.2 g·L-1、 纯化几丁质25 g·L-1、 CaCl2 1 g·L-1、 硼酸0.01 g·L-1、 硫酸锰0.01 g·L-1、 硫酸锌0.07 g·L-1、 硫酸铜0.05 g·L-1、 三氧化钼0.01 g·L-1, pH 7.024。菌落周围有水解圈的为阳性结果。

1.7.7 脲酶活性

在补充有0.5%尿素的YM培养基中检测脲酶活性, 阳性结果为添加1%的溴百里香酚蓝染色后菌落周围显现蓝色晕圈20

1.8 酶活性半定量及数据分析

将所有菌株按2%的接种量接种于MYP20培养基中, 15 ℃静置培养48 h后, 用相差显微镜镜检浓度统一校准为1×106 CFU·mL-1的酵母菌悬液接种在特定底物的琼脂平板上, 15 ℃下培养96 h后测量菌落大小及水解圈、 透明圈、 显色圈半径, 半定量评估菌株的胞外酶活性25。试验数据用Excel2003进行初步处理后, 采用SPSS17.0软件进行统计分析, 采用单因素方差分析(One-way ANOVA)程序进行方差分析22, 结果以“平均值±标准差表示”, P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 冰芯酵母菌的分离及红酵母属酵母菌的系统发育分析

从乌源1号冰川浅冰芯中共分离出317株酵母菌, 扩増酵母菌株的rRNA基因的ITS序列并测序。将代表菌株的ITSrRNA基因序列提交到NCBI, 通过Blast工具在GenBank数据库中与已发表的ITSrRNA基因序列进行相似性比较, 结果显示317株酵母菌可以归类于9个属, 18个种, 每种占总菌数的比例为: Glaciozyma watsonii (6.62%), Mrakia gelida (5.68%)、 Mrakiella aquatica (6.31%)、 Naganishia albidus (6.31%)、 Naganishia adeliensis (6.94%)、 Vishniacozyma carnescens (1.58%)、 Cystofilobasidium macerans (4.73%)、 Filobasidium magnum (8.52%)、 Candida glabrata (14.51%)、 Vishniacozyma tephrensis (3.15%)、 Naganishia albida (4.42%)、 Naganishia adeliensis (15.14%)、 Rhodotorula glutinis (5.68%)、 Rhodotorula diobovata (0.63%)、 Rhodotorula araucariae (1.89%)、 Rhodotorula kratochvilovae (1.58%)、 Rhodotorula mucilaginosa (4.73%)。

将45株红酵母菌进行MSP-PCR指纹图谱对比, 并根据指纹图谱对45株菌进行归类划分(表1)。并对红酵母进行ITS序列分析, 选取相似性在99%以上的代表菌株构建系统发育树(图1), 其中8株菌的ITS区基因序列与R.glutinis的相似性达到100%。YHB-13、 YHB-16、 YHB-34与R.kratochvilovae的亲缘关系最近, 同源性高达100%。R.kratochvilovaeR.glutinis两个种群之间的亲缘关系非常近, 位于同一个进化枝。菌株YHB-22与R.diobovata亲缘关系最近, 相似性100%。YHB-3、 YHB-53、 YHB-21、 YHB-44聚为一类, 与R.mucilaginosa的同源性最高, 相似性达到99%。YHB-8与R.araucariae的ITS区基因序列相似性在99%以上。

表1   乌源1号冰川浅冰芯中低温红酵母菌的特征

Table 1  Characteristics of cold-adapted Rhodotorula in ice core on the surface of the Urumqi Glacier No.1, Tianshan Mountains

菌株a亲缘关系代表菌株 登录号生长特性
BLAST最匹配种相似性/%最适生长温度/℃b耐盐度/%c
YHB-34Rhodotorula kratochvilovae100MH8020034~24~370~6
YHB-13, YHB-24Rhodotorula kratochvilovae100MH8019934~24~300~6
YHB-16Rhodotorula kratochvilovae100MH8019954~24~300~6
YHB-4, YHB-14, YHB-15Rhodotorula glutinis100MH8019944~21~370~6
YHB-6, YHB-1, YHB-2, YHB-7Rhodotorula glutinis100MH8019914~24~300~8
YHB-20, YHB-38, YHB-23, YHB-26Rhodotorula glutinis100MH8019974~21~300~6
YHB-31, YHB-27Rhodotorula glutinis100MH8020014~24~370~8
YHB-29Rhodotorula glutinis100MH8020004~24~370~8
YHB-33Rhodotorula glutinis100MH8020024~24~370~4
YHB-35, YHB-39Rhodotorula glutinis100MH8020044~21~300~8
YHB-47Rhodotorula glutinis100MH8020064~24~300~8
YHB-48Rhodotorula araucariae99MH8020074~24~370~8
YHB-8, YHB-46, YHB-49Rhodotorula araucariae99MH8019924~24~300~6
YHB-18, YHB-25Rhodotorula araucariae99MH8019964~24~300~8
YHB-22, YHB-9Rhodotorula diobovata100MH8019994~24~300~8
YHB-44Rhodotorula mucilaginosa99MH8020054~24~370~8
YHB-53, YHB-42, YHB-45, YHB-50Rhodotorula mucilaginosa99MH8020084~24~370~8
YHB-3, YHB-1, YHB-52, YHB-54, YHB-37Rhodotorula mucilaginosa99MH8019904~21~370~8
YHB-21, YHB-17, YHB-28, YHB-32, YHB-40Rhodotorula mucilaginosa99MH8019984~21~370~8

注:a,此列数据第一个菌株为该酵母菌种的代表菌株;b,此列数据为酵母菌最低~最适~最高生长温度;c,此列数据为酵母菌生长的耐盐度范围。

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图1

图1   基于ITS基因序列的代表酵母菌菌株的系统发育树

Fig.1   Neighbour-joining tree showing the phylogenetic relationships among representative yeast strains. Numbers at the nodes indicate the bootstrap values based on neighbour-joining analyses of 1 000 resampled datasets


2.2 红酵母属内菌株的菌落和细胞形态特征

乌源1号冰川浅冰芯中分离纯化的红酵母菌的菌落颜色多为粉色或橘红色(图3), 同一种的菌株的菌落颜色也会不同(表2), 例如YHB-4和YHB-6同属于R.glutinis, 颜色分别为橙色和粉红色, YHB-3和YHB-21都属于R.mucilaginosa, 菌落颜色分别为粉色和橙色。红酵母菌的菌落直径约为1~2 mm, 采用光学显微镜观察其细胞形态, 发现其细胞形态主要分为球形和椭球形(表2)。

图2

图2   红酵母菌的MSP-PCR指纹图谱及聚类分析树状图

Fig.2   MSP-PCR fingerprint and cluster analysis tree diagram of Rhodotorula


图3

图3   乌源1号冰川浅冰芯中产酶酵母的菌落形态特征

注:a:R. glutinis (YHB-4);b:R. glutinis(YHB-6);c:R. diobovata(YHB-22);d:R. kratochvilovae(YHB-24);e:R. araucariae(YHB-46);f:R. mucilaginosa(YHB-21);g:R. mucilaginosa(YHB-3);A:蛋白酶活性(YHB-27); B:淀粉酶活性(YHB-24);C:果胶酶活性(YHB-23);D:脂肪酶活性(YHB-25);E:纤维素酶活性(YHB-22);F:脲酶活性(YHB-27);G:几丁质酶活性(YNH-33)

Fig.3   Morphological features of enzyme-producing yeast in ice core on the surface of the Urumqi Glacier No.1, Tianshan Mountains


表2   乌源1号冰川浅冰芯红酵母菌的形态特征及产酶谱

Table 2  Morphological characteristics and enzyme production profile of Rhodotorula in ice core on the surface of the Urumqi Glacier No.1, Tianshan Mountains

菌株形态特征胞外酶活性
菌落大小/mm细胞形态菌落颜色蛋白酶淀粉酶果胶酶脂肪酶纤维素酶脲酶几丁质酶
Rhodotorula glutinis
YHB-12球形橙色--++-+++-
YHB-22球形橙色--++-++++-
YHB-42球形橙色-+++++-+--
YHB-62球形粉色--+-+++-
YHB-72球形橙色-+++++-++++-
YHB-142椭球形橙色-++-++++++-
YHB-152椭球形粉色+++++-+++++-
YHB-201-2椭球形橙色--+-+++++-
YHB-232椭球形橙色-+++++-++++++-
YHB-262球形橙色--+-+++-
YHB-271球形橙色+-+-++-
YHB-292球形橙色+-+-++--
YHB-312球形粉色+-+-++--
YHB-331椭球形橙色--+-++++-
YHB-351球形粉色-++-+++-
YHB-381球形粉色-+++-++--
YHB-391球形粉色-++++++--
YHB-471球形粉色-++-+++++-
Rhodotorula kratochvilovae
YHB-241球形橙色-+++-++++++-
YHB-132椭球形橙色--+----
YHB-162椭球形橙色-+++-+++++-
YHB-341球形橙色-++-++++-
Rhodotorula mucilaginosa
YHB-32椭球形粉色+-++-++--
YHB-172椭球形粉色--+-++++-
YHB-212椭球形橙色--++-+++-
YHB-281球形粉色--+-++--
YHB-321球形粉色+-+-++--
YHB-371球形粉色--+-++++-
YHB-401球形粉色--++-++--
YHB-421椭球形粉色+-++-+++-
YHB-442椭球形粉色+-++-++--
YHB-451椭球形粉色+++-+--
YHB-503椭球形橙色--++-++--
YHB-511椭球形粉色--++-++--
YHB-521椭球形粉色--++-++--
YHB-533椭球形粉色--++-+++--
YHB-542椭球形粉色--++-+++-
Rhodotorula araucariae
YHB-82椭球形橙色-++-+++++-
YHB-182球形橙色--++-+++++-
YHB-251椭球形橙色--+++++--
YHB-463球形粉色-++-++-
YHB-483球形粉色--+-+--
YHB-492球形橙色-++-++--
Rhodotorula diobovata
YHB-93球形粉色-+++++++++++-
YHB-223球形粉色--+++++--
总菌数45
阳性菌株数111845444250
阳性菌株占总菌数的百分比(%)24.4401008.997.855.60

注:+为直径2.0~6.5 mm;++为直径7.0~10.5 mm;+++为直径11~15 mm;-为没有酶活性。

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2.3 基于MSP-PCR指纹的红酵母属内菌株的遗传差异

采用GelCompar II5.10(Applied Maths, Sint-Martens-Latem, Belgium)凝胶分析软件对红酵母属内菌株的MSP-PCR扩增产物进行分析, 相似性分析采用Pearson系数, 使用UPGMA输出树状图, 结果如图2所示。从聚类图可以看出, 菌株明显分为5个亚群, 每个菌株产生的条带数在4~14之间。YHB-15、 YHB-23同为R.glutinis, 因为基因带型与其他同种菌株差别较大, 成为一个单独的亚群。R.diobovata、 R.glutinisR.araucariaeR.kratochvilovae四个种的基因带型显示它们的亲缘关系相近, 聚类为一个亚群10株R.glutinis聚类为第三个亚群。YHB-48、 YHB-49、 YHB-28对应于两个不同的种, 但指纹图谱显示两个种的亲缘关系较近, 聚类为第四个亚群。R.mucilaginosa具有相同或相似的基因带型, 聚集为第五个亚群, YHB-29属于R.glutinis但与R.mucilaginosa的基因带型更相近, 归类于同一个亚群。

2.4 红酵母属内菌株的最适生长温度和耐盐度

实验结果表明(表1), 26株菌的最高生长温度为37 ℃, 19株菌的最高生长温度为30 ℃。26株菌的最适生长温度在24 ℃左右, 生长温度范围在4~37 ℃, 19株菌的最适生长温度为21 ℃左右, 在30 ℃时停止生长, 所有菌株都属于耐冷菌的范围。在耐盐性的研究中, 大多数菌株在8% NaCl浓度下才停止生长。14株菌的耐盐度为6%, 耐盐度最低的是YHB-33, NaCl浓度高于4%停止生长。

2.5 红酵母属内菌株产胞外酶的种系差异

一共测定了45株菌的7种胞外酶活性, 用培养基中透明圈或水解圈的大小半定量一系列酶的活性, 图3为15 ℃培养96 h后酵母菌在7种培养基上产生的水解圈的典型图像。如表2所示, 15 ℃时所有酵母菌至少具有2种胞外酶活性。45株菌中, 有8.89%的株菌显示出5种酶活性, 分别为R.diobovata YHB-9、 R.glutinis(YHB-39、 YHB-15)、 R.mucilaginosa YHB-45。

纤维素酶活性普遍很高, 只有R.kratochvilovae YHB-31没有纤维素酶活性, 活性最高的是菌株YHB-14和YHB-20。所有菌株都具有果胶酶活性, 可以在果胶酶筛选平板上产生清晰的透明圈, R.glutinis YHB-23的活性最高。所有菌株都不能产生几丁质酶。具有淀粉酶活性和脲酶活性的菌株各占总菌数的46.67%, 15株R.mucilaginosa中, 只有YHB-44一株菌产淀粉酶, 其余14株菌都没有淀粉酶活性。YHB-9和YHB-22同属于R.diobovata, 但只有YHB-22可以分解尿素。脂肪酶活性发现的较少, 只有8.89%的株菌具有脂肪酶活性, 分别为YHB-9、 YHB-22、 YHB-25、 YHB-39, 没有筛选到可以产生脂肪酶的R.mucilaginosaR.kratochvilovae。显示蛋白酶活性的株菌占总菌数的20%, 但可以水解酪蛋白的只有R.glutinisR.mucilaginosa两个种群的酵母菌, 其他三个种的红酵母菌都不具有产胞外蛋白酶的特性。

2.6 产酶菌株的表型聚类分析

产酶菌株的聚类分析显示(图4), 具有相同或相似产酶多样性的菌株聚为一簇, 聚类结果与分子鉴定结果比较发现红酵母的产酶特性在种水平上的差异性不明显。种间的产酶多样性及酶活性基本类似。YHB-1、 YHB-2同属于R.glutinis聚为一簇。YHB-51、 YHB-52、 YHB-53同属于R.mucilaginosa聚为一簇。YHB-4、 YHB-22、 YHB-25、 YHB-46分别属于4个不同的种, 表现出最大的种间差异和产酶差异性。而YHB-8和YHB-16分别属于R.araucariaeR.kratochvilovae两个不同的种, 因产酶结果相同聚成一簇。同一个种群的酵母菌的酶活性也存在差异性, 图4颜色越深的区域代表酶活性越高, 反之酶活性越低。方差分析结果如表3所示, 各个种群与产酶种类、 活性之间差异不显著(P>0.05)。

图4

图4   菌株酶活性(透明圈直径, 单位: mm)的热图及聚类分析图

注:Pec:果胶酶活性;Cel:纤维素酶活性;Ure:脲酶活性;Amy:淀粉酶活性;Lip(Tween80): 脂肪酶活性;Pro:蛋白酶活性;Chi:几丁质酶活性

Fig.4   Heat map and clustering tree of yeast species enzyme activity (diameter of transparent zone, unit: mm)


表3   红酵母菌不同种之间酶活性的差异

Table 3  Differences in enzyme activities between different species of Rhodotorula

种属胞外酶活性(透明圈直径)/mm
蛋白酶淀粉酶果胶酶脂肪酶纤维素酶脲酶几丁质酶
R.glutinis0.69±1.613.65±4.496.38±2.380.24±0.9710.48±3.535.92±4.810.00±0.00
R.mucilaginosa1.78±1.890.23±0.907.03±1.650.00±0.009.33±1.422.17±3.360.00±0.00
R.araucariae0.00±0.002.56±2.965.00±2.141.33±3.277.50±1.905.37±6.670.00±0.00
R.diobovata1.83±3.174.17±7.215.33±3.251.33±1.5410.50±4.336.57±6.870.00±0.00
R.kratochvilovae0.00±0.004.75±3.525.50±2.040.00±0.007.63±6.138.05±5.840.00±0.00

注:经方差分析,种间酶活性无显著性差异(P>0.05),“±”后的数字表示标准差。

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3 讨论

根据文献报道, 南极、 北极及环北极地区、 中低纬度山岳冰川环境中最常见的可培养酵母菌有Cryptococcus、 RhodotorulaMrakia26等担子菌纲酵母菌, 而RhodotorulaCryptococcus在低温环境中是绝对优势的属27。其中南极、 北极、 欧洲冰川、 南美洲冰川和深海中最常见的红酵母种包括R.aurantiaca、 Phenoliferia glacialis (以前称Rhodotorula glacialis、 Cytstobasidium minuta (以前称Rhodotorula minuta、 R.glutinis、 R.mucilaginosa、 R.diobovata (以前称Rhodosporidium diobovatum)和R.kratochvilovae。在欧洲冰川生境中特有的种有Phenoliferia psychrophenolica (以前称Rhodotorula psychrophenolicaPhenoliferia psychrophila (以前称Rhodotorula psychrophila), 而在南极地区土壤分布的特有种包括Colacogloea diffluens (以前称Rhodotorula diffluens)、 Sampaiozyma ingeniose (以前称Rhodotorula ingeniose、 R.auriculariaeCytstobasidium pallidas(以前称Rhodotorula pallidas)。R.araucariae大多分离自腐烂的植物体表12, 在冰川浅冰芯中很少报道, 从乌源1号冰川冰芯中分离出的该菌种很可能是由风等外力作用将其带到冰川表面, 并被沉降到冰芯中。一般认为, 0 ℃以下水被冻结生命无法利用, 因此冰川中的酵母菌面临着最主要生存压力也是水分的获取。研究发现由于受冰晶周围存在的盐分的影响, 冰晶之间的液态水在-30 ℃的仍可保持液态, 并且不容易受到大气升华或蒸发的影响, 是冰川内部包括酵母菌在内的各种生命可以存活的主要原因28。因此, 来自冰川冰芯的微生物往往具有一定的耐盐性。本研究显示, 分离红酵母菌的最高耐盐度为8%, 这与北极冰川酵母基本一致29。此外, 生存于冰川中的微生物为了适应低温环境, 最适生长温度相对较低, 依据对温度的生长敏感性, 可将其分为宽温型和窄温型。已经报道的酵母菌中, CryptococcusRhodotorulaMrakia属的一些种被发现是专性嗜冷菌, 属于窄温型。一些报道的冰川红酵母其最适生长温度一般在20 ℃左右30。本研究分离的所有菌株其最适生长温度在21 ℃或24 ℃左右, 在30 ℃、 甚至37 ℃能够缓慢生长, 应该属于宽温型的兼性耐冷微生物。

报道显示, 低温条件下的酵母菌相比细菌具有更强的降解惰性有机大分子(纤维素、 木质素等)的能力31, 很可能是因为酵母菌具有更独特的产酶谱, 使它们可以利用细菌难以降解的碳源在特殊环境中生存。由于这个原因, 酵母菌在冰川生境的碳素营养循环中发挥重要的作用32。本研究中的大多数菌株能在低温下产生一种或几种胞外酶, 其中产纤维素酶和果胶酶的菌株最多。文献报道显示, 纤维素酶是高山冰川酵母菌中最常见的胞外酶之一(仅次于脂肪酶), 譬如巴塔哥尼亚安第斯山脉有63%的冰川酵母菌可以产生纤维素酶25-33。此外, 低温酵母菌分泌果胶酶的频率也很高, 阿尔卑斯冰川中的19株红酵母菌有60%可以产生果胶酶33。本研究分离的45株菌, 均可以产生果胶酶, 除一株外均产纤维素酶。相对而言, 冰川环境中能够产几丁质酶的温酵母菌报道很少33。本研究分离的45株同样没发现产胞外几丁质酶的菌株, 很可能与冰川环境中几丁质本身缺乏有关, 而在同样低温的海洋低温酵母中, 产几丁质酶菌株的分离频率极高。这种现象支持一个观点, 生境过滤是微生物地理分布更强的决定因子34-35。此外, 文献报道南极、 亚南极和高山冰川中分离出的酵母菌中只有少部分菌株具有淀粉酶活性, 主要集中在MrakiaRhodotorula这两个属36。脂肪酶是低温酵母菌产生的最常见的一种酶25, 已经在Cryptococcus、 Dioszegia、 LeuconeurosporaRhodotorulaWickerhamomyces等属菌株广泛报道37。有研究发现来自北极Midre Lovénbreen冰川附近水坑中的红酵母菌都不能产生脂肪酶21, 这与本文研究结果相似, 本文中产脂肪酶红酵母菌株只占9%, 因此我们推测产脂肪酶酵母菌的地理分布可能会受到生长环境的影响。Duarte等26研究表明, 有14%的南极酵母能够在固体或者液体介质中生产蛋白酶, 对蛋白酶描述最多的几个种属分别为Cryptococcus、 Mrakia、 Leucosporidium、 PichiaRhodotorula37。本实验有20%的菌株可以产生蛋白酶, 但活性稍低。

一般认为, 温度是冷环境中的微生物群落分布的最关键因子, 但是高山冰川生境中紫外线辐射也是最关键因子之一。只有具有光保护机制的微生物才能在高紫外线辐射的环境中定植, 譬如类胡萝卜素是微生物中最常见的光保护剂。迄今为止, 已经在多个酵母属中检测到类胡萝卜素, 譬如CryptococcusCystofilobasidiumDioszegiaPhaffiaSporidiobolusSporobolomycesTaphrinaRhodotorula23-38。报道发现, 巴塔哥尼亚淡水体系中有50%左右的酵母菌含有类胡萝卜素39, 而在酵母菌中最常见的几种类胡萝卜素主要有圆酵母素, β-胡萝卜素和γ-胡萝卜素40。酵母菌产生类胡萝卜素的比例和类型主要取决于它们系统发育地位和培养基, 如类胡罗素之一的圆酵母素通常由R.minuta菌株产生, R.mucilaginosaR.glutinis菌株主要产生另外一类胡罗素——红酵母红素, 而R.babjevae即产圆酵母素和又能产红酵母红素; 此外, R.sphaerocarpumR.graminis主要产生β-胡萝卜素41。据文献报道, 结合在微生物细胞膜上的色素还具有调节细胞膜的流动性的特点42-43, 可使微生物更好地适应低温环境。因此, 对低温红酵母产类胡萝卜素的性能及其遗传背景差异进行深入研究具有重要意义, 本文将对分离菌株进一步研究, 并另撰文报道。此外, 耐低温酵母菌不仅能产生胞外酶和类胡萝卜素, 还可以产生具有工业应用价值的胞外多糖, 被广泛用于食品、 化妆品、 制药等工业中, 其应用前景非常广阔。近年来, 由于β-葡聚糖具有抗肿瘤、 抗氧化等特性而被广泛研究, 研究表明CandidaCryptococcusLipomycesPichiaRhodotorulaSporobolomyces可以合成甘露聚糖、 葡聚糖、 葡甘露聚糖、 半乳甘露聚糖、 磷酸甘露聚糖和葡糖醛酸甘露聚糖44。微生物产生的胞外多糖的结构、 数量和性质主要取决于菌株的遗传特性、 培养基组成和生长条件, 实现胞多糖的大规模生产具有重要的工业意义。

4 结论

(1) 乌鲁木齐河源乌源1号冰川浅冰芯中红酵母菌(Rhodotorula)菌株至少包括5个可培养物种R.glutinisR.araucariaeR.mucilaginosaR.kratochvilovaeR.diobovata, 隶属于同一种的菌株之间存在明显的遗传差异。

(2) 冰芯中所有红酵母菌(Rhodotorula)菌株菌株至少产两种胞外酶, 其中少部分产五种酶, 绝大部分产纤维素酶和果胶酶菌, 产蛋白酶和脂肪酶的菌株相对较少, 但所有菌株都不产几丁质酶。菌株的最适生长温度在21~24 ℃左右, 属于耐冷酵母菌。此外, 冰川分离出的红酵母的产酶性状没有表现出物种特异性, 即产酶特性物种间的差异没有明显的规律性; 产低温酶性能良好, 在生物技术应用方面具有良好的开发潜力。

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